PCR တုံ့ပြန်မှုများတွင် အနှောင့်အယှက်အချက်များ

PCR တုံ့ပြန်မှုအတွင်း၊ အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသောအချက်အချို့ကို မကြာခဏကြုံတွေ့ရသည်။
PCR ၏ အလွန်မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းကြောင့်၊ ညစ်ညမ်းမှုသည် PCR ရလဒ်များကို ထိခိုက်စေသော အရေးကြီးဆုံးအချက်များထဲမှ တစ်ခုဖြစ်သည်ဟု ယူဆကြပြီး မှားယွင်းသောအပြုသဘောရလဒ်များကို ထုတ်ပေးနိုင်သည်။
မှားယွင်းသော-အနုတ်လက္ခဏာရလဒ်များဆီသို့ ဦးတည်စေသည့် ရင်းမြစ်များ တူညီစွာ ဝေဖန်ထောက်ပြကြသည်။ PCR အရောအနှော၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း သို့မဟုတ် တစ်ခုထက်ပိုသော မရှိမဖြစ်အစိတ်အပိုင်းများ သို့မဟုတ် ချဲ့ထွင်မှုတုံ့ပြန်မှုကိုယ်တိုင်က ဟန့်တားခြင်း သို့မဟုတ် နှောင့်ယှက်ခြင်းဖြစ်ပါက၊ ရောဂါရှာဖွေစစ်ဆေးမှုကို အဟန့်အတားဖြစ်စေနိုင်သည်။ ၎င်းသည် ထိရောက်မှု လျော့ကျစေပြီး မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာရလဒ်များကိုပင် ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။
ဟန့်တားခြင်းအပြင်၊ နမူနာပြင်ဆင်မှုမပြုလုပ်မီ ပို့ဆောင်မှုနှင့်/သို့မဟုတ် သိုလှောင်မှုအခြေအနေများကြောင့် ပစ်မှတ်နျူကလိစ်အက်ဆစ်၏ ခိုင်မာမှု ဆုံးရှုံးသွားနိုင်သည်။ အထူးသဖြင့် မြင့်မားသော အပူချိန် သို့မဟုတ် လုံလောက်သော သိုလှောင်မှု မလုံလောက်ခြင်းသည် ဆဲလ်များနှင့် နူကလိစ်အက်ဆစ်များကို ပျက်စီးစေနိုင်သည်။ ဆဲလ်နှင့် တစ်ရှူးများကို ပြုပြင်ခြင်းနှင့် paraffin မြှပ်နှံခြင်းသည် DNA အကွဲကွဲအပြားပြားဖြစ်ရခြင်း၏ အကြောင်းရင်းများနှင့် မြဲမြံသောပြဿနာဖြစ်သည် (ပုံ 1 နှင့် 2 ကိုကြည့်ပါ)။ ဤကိစ္စများတွင်၊ အကောင်းဆုံးအထီးကျန်ခြင်းနှင့် သန့်စင်ခြင်းသည်ပင် အထောက်အကူမဖြစ်ပါ။

ပုံ 1 | DNA သမာဓိရှိမှုအပေါ် လှုပ်ရှားခြင်း၏ သက်ရောက်မှု
Agarose gel electrophoresis သည် ခွဲစိတ်မှု၏ paraffin အပိုင်းများမှ သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော DNA ၏ အရည်အသွေးသည် သိသိသာသာ ကွဲပြားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ပြုပြင်သည့်နည်းလမ်းပေါ် မူတည်၍ ထုတ်ယူမှုတွင် မတူညီသော ပျမ်းမျှအပိုင်းအလျားများ၏ DNA ရှိသည်။ မူရင်းအေးခဲထားသောနမူနာများတွင် နှင့် ဘက်မလိုက်သော ဖော်မလင်ဖြင့် ပြုပြင်ထားမှသာ DNA ကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ပြင်းပြင်းထန်ထန် အက်ဆစ်ဓာတ်ရှိသော Bouin fixative သို့မဟုတ် ဖော်မလင်အက်ဆစ်ပါဝင်သော ဖော်မလင်ကို အသုံးပြုခြင်းသည် DNA ကို သိသိသာသာ ဆုံးရှုံးစေပါသည်။ ကျန်အပိုင်းသည် အလွန်အစိတ်စိတ်အမွှာမွှာကွဲနေပါသည်။
ဘယ်ဘက်တွင်၊ အပိုင်းအစများ၏ အရှည်ကို kilobase အတွဲများ (kbp) ဖြင့် ဖော်ပြသည်

ပုံ 2 | nucleic acid ပစ်မှတ်များ၏ ခိုင်မာမှု ဆုံးရှုံးခြင်း။
(က) ကြိုးနှစ်ခုလုံးရှိ 3′-5′ ကွာဟမှုသည် ပစ်မှတ် DNA တွင် ကွဲသွားမည်ဖြစ်သည်။ DNA ၏ပေါင်းစပ်မှုသည်သေးငယ်သောအပိုင်းအစပေါ်တွင်ဆက်လက်ဖြစ်ပေါ်လိမ့်မည်။ သို့သော်၊ DNA အပိုင်းအစတွင် primer annealing site ပျောက်ဆုံးပါက linear amplification သာလျှင် ဖြစ်ပေါ်ပါသည်။ အဆင်အပြေဆုံးအခြေအနေတွင်၊ အပိုင်းအစများသည် တစ်ခုနှင့်တစ်ခု ပြန်ဖြစ်လာနိုင်သော်လည်း အထွက်နှုန်းမှာ သေးငယ်ပြီး ထောက်လှမ်းမှုအဆင့်များအောက်တွင် ရှိနေမည်ဖြစ်သည်။
(ခ) အဓိကအားဖြင့် depurination နှင့် thymidine dimer ဖွဲ့စည်းခြင်းကြောင့် အခြေခံများ ဆုံးရှုံးမှုသည် H-bonds အရေအတွက် ကျဆင်းခြင်းနှင့် Tm လျော့နည်းခြင်းတို့ကို ဖြစ်စေသည်။ ရှည်လျားသောပူနွေးမှုအဆင့်တွင်၊ primers များသည် matrix DNA မှ အရည်ပျော်သွားမည်ဖြစ်ပြီး တင်းကြပ်မှုနည်းပါးသောအခြေအနေအောက်တွင်ပင် မှေးမှိန်သွားမည်မဟုတ်ပါ။
(ဂ) ကပ်လျက်စမုန်ဖြူခြေစွပ်များသည် TT dimer ပုံစံဖြစ်သည်။
မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေရေးတွင် မကြာခဏဖြစ်ပွားလေ့ရှိသည့် နောက်ထပ်ပြဿနာတစ်ခုမှာ ဖီနော-ကလိုရိုဖောင်ထုတ်ယူခြင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပစ်မှတ်နျူကလိစ်အက်ဆစ်များကို အကောင်းမွန်ဆုံးထုတ်လွှတ်မှုထက် နည်းပါသည်။ လွန်ကဲသော ကိစ္စများတွင်၊ ၎င်းသည် မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာများနှင့် ဆက်စပ်နိုင်သည်။ ဆဲလ်အညစ်အကြေးများကို ဆူအောင်ထုတ်ခြင်း သို့မဟုတ် ဆဲလ်အပျက်အစီးများကို အင်ဇိုင်းဖြင့် ချေဖျက်ခြင်းဖြင့် အချိန်များစွာကို ကယ်တင်နိုင်သော်လည်း ဤနည်းလမ်းသည် နျူကလိယအက်ဆစ်ထုတ်လွှတ်မှု မလုံလောက်ခြင်းကြောင့် PCR sensitivity နည်းပါးစေသည်။

ချဲ့ထွင်နေစဉ်အတွင်း polymerase လုပ်ဆောင်မှုကို ဟန့်တားခြင်း။

ယေဘုယျအားဖြင့်၊ တားမြစ်ခြင်းကို ကွန်တိန်နာအယူအဆအဖြစ် အသုံးပြုပြီး အကောင်းဆုံး PCR ရလဒ်များကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် အချက်အားလုံးကို ဖော်ပြရန် အသုံးပြုသည်။ တင်းကြပ်စွာ ဇီဝဓာတုသဘောအရ၊ ၎င်းသည် အင်ဇိုင်း၏လုပ်ဆောင်မှုကို ကန့်သတ်ခြင်းဖြစ်သည်၊ ဆိုလိုသည်မှာ၊ ၎င်းသည် DNA polymerase သို့မဟုတ် ၎င်း၏ cofactor (ဥပမာ၊ Taq DNA polymerase အတွက် Mg2+) နှင့် အောက်စထရိတ်-ထုတ်ကုန်ပြောင်းလဲခြင်းကို လျှော့ချခြင်း သို့မဟုတ် တားဆီးကာကွယ်ပေးသည်။
နမူနာတွင် ပါဝင်သည့် အစိတ်အပိုင်းများ သို့မဟုတ် အမျိုးမျိုးသော ကြားခံများနှင့် ဓာတ်ပြုပစ္စည်းများပါရှိသော ကောက်နုတ်ချက်များသည် အင်ဇိုင်းကို တိုက်ရိုက် ဟန့်တားနိုင်သည် သို့မဟုတ် ၎င်း၏ cofactors (ဥပမာ EDTA) ကို တားစီးနိုင်သောကြောင့် ပေါ်လီမာရစ်ကို အသက်မဝင်စေဘဲ လျော့နည်းသွားသော သို့မဟုတ် မှားယွင်းသော PCR ရလဒ်များဆီသို့ ဦးတည်သွားစေနိုင်သည်။
သို့သော်လည်း၊ တုံ့ပြန်မှု အစိတ်အပိုင်းများနှင့် ပစ်မှတ်ပါရှိသော နျူကလိစ်အက်ဆစ်များအကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို 'PCR inhibitors' အဖြစ် သတ်မှတ်သည်။ အထီးကျန်ခြင်းဖြင့် ဆဲလ်များ၏ ခိုင်မာမှုကို ရပ်တန့်စေပြီး nucleic acid ကို ထုတ်လွှတ်လိုက်သည်နှင့်၊ နမူနာနှင့် ၎င်း၏ ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ ပျော်ရည်နှင့် အစိုင်အခဲအဆင့်တို့ကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုများ ဖြစ်ပေါ်နိုင်သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ 'scavengers' သည် တစ်ခုတည်းသော သို့မဟုတ် နှစ်ဆသော DNA ကို covalent မဟုတ်သော အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများမှတဆင့် ချည်နှောင်နိုင်ပြီး နောက်ဆုံးတွင် PCR တုံ့ပြန်မှုသင်္ဘောသို့ရောက်ရှိမည့် ပစ်မှတ်အရေအတွက်ကို လျှော့ချခြင်းဖြင့် အထီးကျန်ခြင်းနှင့် သန့်စင်ခြင်းကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေနိုင်သည်။
ယေဘူယျအားဖြင့်၊ PCR inhibitors များသည် ဆေးဘက်ဆိုင်ရာရောဂါရှာဖွေစမ်းသပ်မှုများအတွက်အသုံးပြုသော ခန္ဓာကိုယ်အရည်များနှင့် ဓာတ်ပစ္စည်းများ (ဆီးထဲတွင်ယူရီးယား၊ ဟေမိုဂလိုဘင်နှင့်သွေးထဲတွင် heparin)၊ အစားအသောက်ဖြည့်စွက်စာ (အော်ဂဲနစ်အစိတ်အပိုင်းများ၊ glycogen၊ အဆီ၊ Ca2+ အိုင်းယွန်း) နှင့် ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ အစိတ်အပိုင်းများ (phenols လေးလံသောသတ္တုများ)

ပိုမိုပျံ့နှံ့နေသော PCR inhibitors များကို ဘက်တီးရီးယားနှင့် eukaryotic ဆဲလ်များ၊ ပစ်မှတ်မဟုတ်သော DNA၊ တစ်ရှူး matrices များ၏ DNA-binding macromolecules များနှင့် လက်အိတ်များနှင့် ပလတ်စတစ်များကဲ့သို့သော ဓာတ်ခွဲခန်းသုံးပစ္စည်းများတွင် တွေ့ရှိနိုင်သည်။ ထုတ်ယူနေစဉ် သို့မဟုတ် ပြီးနောက် နျူကလိစ်အက်ဆစ်များကို သန့်စင်ခြင်းသည် PCR inhibitors များကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် ဦးစားပေးနည်းလမ်းဖြစ်သည်။
ယနေ့တွင်၊ အလိုအလျောက် ထုတ်ယူသည့် ကိရိယာ အမျိုးမျိုးသည် လက်စွဲပရိုတိုကော အများအပြားကို အစားထိုးနိုင်သော်လည်း ပစ်မှတ်များကို 100% ပြန်လည်ရယူခြင်းနှင့်/သို့မဟုတ် သန့်စင်ခြင်းတို့ကို မည်သည့်အခါမျှ မအောင်မြင်ခဲ့ပေ။ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော inhibitors များသည် သန့်စင်ထားသော nucleic acids များတွင် ရှိနေနိုင်သည် သို့မဟုတ် အကျိုးသက်ရောက်ပြီးသားဖြစ်နိုင်သည်။ inhibitors များ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုကိုလျှော့ချရန်ကွဲပြားခြားနားသောဗျူဟာများရှိသည်။ သင့်လျော်သော polymerase ရွေးချယ်မှုသည် inhibitor လုပ်ဆောင်ချက်အပေါ်သိသိသာသာသက်ရောက်မှုရှိသည်။ PCR တားဆီးမှုကို လျှော့ချရန် အခြားသော သက်သေပြနည်းလမ်းများမှာ polymerase အာရုံစူးစိုက်မှု တိုးလာခြင်း သို့မဟုတ် BSA ကဲ့သို့သော ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများကို အသုံးပြုခြင်း ဖြစ်သည်။
အတွင်းပိုင်းလုပ်ငန်းစဉ်အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု (IPC) ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့် PCR တုံ့ပြန်မှုကိုတားမြစ်နိုင်သည်။
သန့်စင်သောဆေးကြောခြင်းအဆင့်ဖြင့် အီသနော၊ EDTA၊ CETAB၊ LiCl၊ GuSCN၊ SDS၊ isopropanol နှင့် phenol ကဲ့သို့သော ထုတ်ယူကိရိယာရှိ ဓာတ်ပစ္စည်းများနှင့် အခြားဖြေရှင်းနည်းအားလုံးကို ဖယ်ရှားရန် ဂရုပြုရပါမည်။ ၎င်းတို့၏ အာရုံစူးစိုက်မှုအပေါ်မူတည်၍ PCR ကို အသက်သွင်းခြင်း သို့မဟုတ် တားဆီးနိုင်သည်။