PCR တုံ့ပြန်မှုများတွင် အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသောအချက်များ

PCR တုံ့ပြန်မှုအတွင်း အချို့သော အနှောင့်အယှက်ပေးသည့်အချက်များနှင့် မကြာခဏ ကြုံတွေ့ရလေ့ရှိသည်။
PCR ၏ အလွန်မြင့်မားသော အာရုံခံနိုင်စွမ်းကြောင့် ညစ်ညမ်းမှုသည် PCR ရလဒ်များကို ထိခိုက်စေသော အရေးကြီးဆုံးအချက်များထဲမှ တစ်ခုအဖြစ် သတ်မှတ်ခံရပြီး မှားယွင်းသော အပြုသဘောဆောင်သော ရလဒ်များကို ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။
မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာရလဒ်များဆီသို့ ဦးတည်စေသော အရင်းအမြစ်အမျိုးမျိုးသည်လည်း အလားတူအရေးကြီးပါသည်။ PCR ရောစပ်မှု၏ မရှိမဖြစ်အစိတ်အပိုင်းတစ်ခု သို့မဟုတ် တစ်ခုထက်ပိုသော အစိတ်အပိုင်းများ သို့မဟုတ် amplification reaction ကိုယ်တိုင်က တားဆီးခံရခြင်း သို့မဟုတ် အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပါက ရောဂါရှာဖွေစမ်းသပ်မှုကို အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေနိုင်သည်။ ၎င်းသည် ထိရောက်မှုလျော့နည်းစေပြီး မှားယွင်းသော အနုတ်လက္ခဏာရလဒ်များကိုပင် ဖြစ်ပေါ်စေနိုင်သည်။
တားဆီးခြင်းအပြင်၊ နမူနာပြင်ဆင်မှုမပြုမီ ပို့ဆောင်ခြင်းနှင့်/သို့မဟုတ် သိုလှောင်မှုအခြေအနေများကြောင့် ပစ်မှတ်နျူကလစ်အက်ဆစ် တည်တံ့မှုဆုံးရှုံးခြင်း ဖြစ်ပေါ်နိုင်သည်။ အထူးသဖြင့် အပူချိန်မြင့်မားခြင်း သို့မဟုတ် မလုံလောက်သော သိုလှောင်မှုသည် ဆဲလ်များနှင့် နျူကလစ်အက်ဆစ်များကို ပျက်စီးစေနိုင်သည်။ ဆဲလ်နှင့် တစ်ရှူးပြုပြင်ခြင်းနှင့် ပါရာဖင်ထည့်သွင်းခြင်းသည် DNA ပြိုကွဲခြင်း၏ လူသိများသော အကြောင်းရင်းများဖြစ်ပြီး ရေရှည်ပြဿနာတစ်ခုဖြစ်သည် (ပုံ ၁ နှင့် ၂ ကိုကြည့်ပါ)။ ဤကိစ္စများတွင်၊ အကောင်းဆုံးအထီးကျန်ခြင်းနှင့် သန့်စင်ခြင်းပင် အထောက်အကူမပြုပါ။

ပုံ ၁ | DNA တည်တံ့ခိုင်မြဲမှုအပေါ် မလှုပ်ရှားနိုင်ခြင်း၏ အကျိုးသက်ရောက်မှု
Agarose gel electrophoresis အရ ရင်ခွဲစစ်ဆေးမှုများ၏ paraffin အပိုင်းများမှ ခွဲထုတ်ထားသော DNA ၏ အရည်အသွေးသည် သိသိသာသာ ကွဲပြားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ပြုပြင်မှုနည်းလမ်းပေါ် မူတည်၍ ထုတ်ယူမှုများတွင် ပျမ်းမျှအပိုင်းအစအရှည် အမျိုးမျိုးရှိသည်။ မူရင်းအေးခဲထားသော နမူနာများနှင့် buffer လုပ်ထားသော ကြားနေ formalin တွင် ပြုပြင်သည့်အခါတွင်သာ DNA ကို ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည်။ အက်ဆစ်ဓာတ် ပြင်းထန်သော Bouin ပြုပြင်မှု သို့မဟုတ် buffered မလုပ်ထားသော၊ formic acid ပါဝင်သော formalin ကို အသုံးပြုခြင်းသည် DNA သိသိသာသာ ဆုံးရှုံးစေခဲ့သည်။ ကျန်ရှိသော အပိုင်းအစသည် အလွန်အပိုင်းအစများ ကွဲအက်နေပါသည်။
ဘယ်ဘက်တွင် အပိုင်းအစများ၏ အရှည်ကို kilobase pairs (kbp) ဖြင့် ဖော်ပြထားပါသည်။

ပုံ ၂ | နျူကလစ်အက်ဆစ်ပစ်မှတ်များ၏ သမာဓိဆုံးရှုံးမှု
(က) ကြိုးနှစ်ချောင်းလုံးတွင် ၃′-၅′ ကွာဟချက်သည် ပစ်မှတ် DNA တွင် ကျိုးပဲ့မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေလိမ့်မည်။ DNA ပေါင်းစပ်မှုသည် အပိုင်းအစငယ်တွင် ဆက်လက်ဖြစ်ပေါ်နေဦးမည်ဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ DNA အပိုင်းအစတွင် primer အပူပေးသည့်နေရာ ပျောက်ဆုံးနေပါက၊ linear amplification သာ ဖြစ်ပေါ်သည်။ အကောင်းဆုံးအခြေအနေတွင်၊ အပိုင်းအစများသည် တစ်ခုနှင့်တစ်ခု ပြန်လည်ပြည့်ဝနိုင်သော်လည်း၊ အထွက်နှုန်းမှာ နည်းပါးပြီး ထောက်လှမ်းမှုအဆင့်အောက်တွင် ရှိလိမ့်မည်။
(ခ) ဘေ့စ်များဆုံးရှုံးခြင်းသည် အဓိကအားဖြင့် သန့်စင်ခြင်းနှင့် သိုင်မီဒင်းဒိုင်မာဖွဲ့စည်းခြင်းကြောင့်ဖြစ်ပြီး H-ချည်နှောင်မှုများအရေအတွက်ကို လျော့ကျစေပြီး Tm ကို လျော့ကျစေသည်။ ရှည်လျားသော နွေးထွေးမှုအဆင့်တွင်၊ ပရိုင်းမာများသည် မက်ထရစ် DNA မှ အရည်ပျော်သွားပြီး တင်းကျပ်မှုနည်းသော အခြေအနေများတွင်ပင် အပူပေးမည်မဟုတ်ပါ။
(ဂ) အနီးနားရှိ သိုင်မင်းဘေ့စ်များသည် TT ဒိုင်မာကို ဖွဲ့စည်းသည်။
မော်လီကျူးရောဂါရှာဖွေရေးတွင် မကြာခဏဖြစ်ပွားလေ့ရှိသော နောက်ထပ်အဖြစ်များသောပြဿနာတစ်ခုမှာ ဖီနော-ကလိုရိုဖောင်းထုတ်ယူမှုနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက ပစ်မှတ်နျူကလစ်အက်ဆစ်များ အကောင်းဆုံးထုတ်လွှတ်မှုထက် နည်းပါးခြင်းဖြစ်သည်။ အလွန်အမင်းကိစ္စများတွင်၊ ၎င်းသည် မှားယွင်းသောအနုတ်လက္ခဏာဆောင်သောရလဒ်များနှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်သည်။ ဆဲလ်အပျက်အစီးများကို ပြုတ်ကျစေသော ပြိုကွဲခြင်း သို့မဟုတ် အင်ဇိုင်းဖြင့် အစာချေခြင်းဖြင့် အချိန်များစွာ သက်သာစေနိုင်သော်လည်း ဤနည်းလမ်းသည် နျူကလစ်အက်ဆစ်ထုတ်လွှတ်မှု မလုံလောက်သောကြောင့် PCR အာရုံခံနိုင်စွမ်း နည်းပါးစေလေ့ရှိသည်။

ချဲ့ထွင်မှုအတွင်း polymerase လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဟန့်တားခြင်း

ယေဘုယျအားဖြင့်၊ inhibition ကို အကောင်းဆုံးမဟုတ်သော PCR ရလဒ်များဆီသို့ ဦးတည်စေသော အချက်အားလုံးကို ဖော်ပြရန် container concept အဖြစ် အသုံးပြုသည်။ တိကျစွာ ဇီဝဓာတုဗေဒ အဓိပ္ပာယ်အရ၊ inhibition သည် အင်ဇိုင်း၏ လုပ်ဆောင်ချက်အတွက်သာ ကန့်သတ်ထားပြီး၊ ဆိုလိုသည်မှာ DNA polymerase ၏ active site သို့မဟုတ် ၎င်း၏ cofactor (ဥပမာ၊ Taq DNA polymerase အတွက် Mg2+) နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုမှတစ်ဆင့် substrate-product conversion ကို လျော့နည်းစေခြင်း သို့မဟုတ် ကာကွယ်ပေးသည်။
နမူနာတွင်ပါဝင်သော အစိတ်အပိုင်းများ သို့မဟုတ် မတူညီသော buffer နှင့် extract များသည် reagents များပါ၀င်သည့် အစိတ်အပိုင်းများသည် အင်ဇိုင်းကို တိုက်ရိုက်ဟန့်တားနိုင်သည် သို့မဟုတ် ၎င်း၏ cofactors (ဥပမာ EDTA) ကို ပိတ်မိစေနိုင်ပြီး polymerase ကို လှုပ်ရှားမှုမရှိစေဘဲ PCR ရလဒ်များကို လျော့နည်းစေခြင်း သို့မဟုတ် မှားယွင်းသော negative ဖြစ်စေသည်။
သို့သော်၊ ဓာတ်ပြုမှု အစိတ်အပိုင်းများနှင့် ပစ်မှတ်ပါဝင်သော နျူကလစ်အက်ဆစ်များအကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု အများအပြားကို 'PCR inhibitors' အဖြစ်လည်း သတ်မှတ်သည်။ ဆဲလ်၏ တည်တံ့မှုကို သီးခြားခွဲထားခြင်းဖြင့် အနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေပြီး နျူကလစ်အက်ဆစ် ထုတ်လွှတ်လိုက်သည်နှင့် နမူနာနှင့် ၎င်း၏ပတ်ဝန်းကျင်ရှိ ပျော်ရည်နှင့် အစိုင်အခဲအဆင့်အကြား အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှု ဖြစ်ပေါ်နိုင်သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ 'scavengers' များသည် covalent မဟုတ်သော အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများမှတစ်ဆင့် single- သို့မဟုတ် double-stranded DNA ကို ချည်နှောင်နိုင်ပြီး PCR ဓာတ်ပြုမှုအိုးသို့ နောက်ဆုံးတွင် ရောက်ရှိသော ပစ်မှတ်အရေအတွက်ကို လျှော့ချခြင်းဖြင့် သီးခြားခွဲထားခြင်းနှင့် သန့်စင်ခြင်းကို အနှောင့်အယှက်ပေးနိုင်သည်။
ယေဘုယျအားဖြင့် PCR inhibitors များသည် ခန္ဓာကိုယ်အရည်အများစုနှင့် ဆေးခန်းရောဂါရှာဖွေရေးစစ်ဆေးမှုများအတွက်အသုံးပြုသော reagents များ (ဆီးထဲရှိ urea၊ သွေးထဲရှိ hemoglobin နှင့် heparin)၊ အစားအသောက်ဖြည့်စွက်စာများ (အော်ဂဲနစ်အစိတ်အပိုင်းများ၊ glycogen၊ အဆီ၊ Ca2+ အိုင်းယွန်းများ) နှင့် ပတ်ဝန်းကျင်ရှိအစိတ်အပိုင်းများ (ဖီနောများ၊ လေးလံသောသတ္တုများ) တွင် ရှိနေပါသည်။

ပိုမိုပျံ့နှံ့နေသော PCR inhibitors များကို ဘက်တီးရီးယားနှင့် eukaryotic ဆဲလ်များ၊ ပစ်မှတ်မဟုတ်သော DNA၊ တစ်ရှူးမက်ထရစ်များ၏ DNA-ချည်နှောင်သည့် မက်ခရိုမော်လီကျူးများနှင့် လက်အိတ်များနှင့် ပလတ်စတစ်များကဲ့သို့သော ဓာတ်ခွဲခန်းပစ္စည်းများတွင် တွေ့ရှိနိုင်သည်။ ထုတ်ယူနေစဉ် သို့မဟုတ် ထုတ်ယူပြီးနောက် nucleic acids များကို သန့်စင်ခြင်းသည် PCR inhibitors များကို ဖယ်ရှားရန်အတွက် ဦးစားပေးနည်းလမ်းဖြစ်သည်။
ယနေ့ခေတ်တွင် အလိုအလျောက်ထုတ်ယူသည့် စက်ကိရိယာအမျိုးမျိုးသည် လက်ဖြင့်လုပ်ဆောင်သော ပရိုတိုကောများစွာကို အစားထိုးနိုင်သော်လည်း ပစ်မှတ်များကို ၁၀၀% ပြန်လည်ရယူခြင်းနှင့်/သို့မဟုတ် သန့်စင်ခြင်းကို ဘယ်သောအခါမှ မရရှိနိုင်ပါ။ သန့်စင်ထားသော နျူကလစ်အက်ဆစ်များတွင် အလားအလာရှိသော inhibitors များ ရှိနေနိုင်သေးသည် သို့မဟုတ် အကျိုးသက်ရောက်ပြီးဖြစ်နိုင်သည်။ inhibitors များ၏ သက်ရောက်မှုကို လျှော့ချရန် ဗျူဟာအမျိုးမျိုး ရှိပါသည်။ သင့်လျော်သော polymerase ရွေးချယ်မှုသည် inhibitor လုပ်ဆောင်ချက်ကို သိသာထင်ရှားစွာ သက်ရောက်မှုရှိနိုင်သည်။ PCR တားဆီးမှုကို လျှော့ချရန် အခြားသက်သေပြထားသော နည်းလမ်းများမှာ polymerase အာရုံစူးစိုက်မှုကို တိုးမြှင့်ခြင်း သို့မဟုတ် BSA ကဲ့သို့သော ဖြည့်စွက်ပစ္စည်းများကို အသုံးပြုခြင်း ဖြစ်သည်။
PCR တုံ့ပြန်မှုများကို ဟန့်တားခြင်းကို အတွင်းပိုင်းလုပ်ငန်းစဉ် အရည်အသွေးထိန်းချုပ်မှု (IPC) ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် သရုပ်ပြနိုင်သည်။
နျူကလစ်အက်ဆစ် သီးခြားထုတ်ယူမှုမှ အီသနော၊ EDTA၊ CETAB၊ LiCl၊ GuSCN၊ SDS၊ isopropanol နှင့် phenol ကဲ့သို့သော ဓါတ်ကူပစ္စည်းများနှင့် အခြားအရည်အားလုံးကို သေချာစွာဆေးကြောသည့်အဆင့်ဖြင့် ဖယ်ရှားရန် ဂရုစိုက်ရမည်။ ၎င်းတို့၏ ပါဝင်မှုပေါ် မူတည်၍ ၎င်းတို့သည် PCR ကို အသက်ဝင်စေ သို့မဟုတ် တားဆီးနိုင်သည်။